微生物基因體定序如何用小數據解讀大規模遺傳資訊

欸，我們身邊那些「隱形室友」要怎麼研究啊？

今天要來聊聊一個...嗯...聽起來很硬核，但其實超有趣的東西：宏基因體學（Metagenomics）。

你知道嗎？我們周遭，不管是土壤、海水、你的皮膚、甚至是腸道裡，都住著幾億幾兆的微生物。但以前科學家要研究牠們，超級麻煩，要一個一個在培養皿上把它們「養」出來看。問題來了，科學界估計有超過九成九的微生物，根本就是養不活的自閉兒，你給牠再好的環境，牠就是不長。

啊這不就等於我們對這個微觀世界幾乎一無所知？這就是宏基因體學要解決的問題。

重點一句話

宏基因體學就是，放棄單獨培養微生物，直接把整個環境樣本裡所有生物的 DNA 全部抽出來，用電腦一次分析完，看看到底有誰在、以及牠們會做些什麼。

所以...這東西能幹嘛？聽起來很學術

不不不，它其實比你想像的更貼近生活。說真的，應用範圍廣到有點誇張。

比方說，研究腸道菌對健康的影響，看看是哪些菌讓你變胖或過敏。或是監測環境污染，看看水質或土壤裡出現了什麼不該出現的壞菌。科學家甚至用它來研究北極冰層裡的古老 DNA、或是從考古遺址挖出來的東西，去還原幾千年前的生態系。更有趣的是，還能從一堆沒看過的微生物裡面，找到可以開發新抗生素或工業用酵素的基因...可能性真的很大。

但，這也代表一件事：資料量，真的，超級無敵大。所以接下來就是一連串跟電腦搏鬥的過程了。

實作指引：從一團亂碼到看懂微生物宇宙

好，假設你已經從環境樣本，比如說你家盆栽的一匙土裡，把 DNA 都抽出來，也送去給公司做完定序了。接下來你拿到的，不會是什麼漂亮的報告，而是一堆看起來像亂碼的檔案。別怕，我們一步一步來拆解。

第一站：品管 (Quality Control) - 挑出資料裡的垃圾

你收到的檔案格式通常是 FASTQ。裡面除了 ATGC 這些鹼基序列外，還有一行看起來更亂的符號，那個其實是「Phred 品質分數」。

我自己是覺得，你可以把它想像成...定序機器在讀取 DNA 時，給自己的信心評分。有點像一個很想睡的打字員，他有時候很確定自己聽到的是 A，有時候會心虛「呃...剛剛那個是 T 還是 C 啊？」。這個品質分數就是它坦白跟你說：「這個鹼基我有 99.9% 的把握是對的」或「這個...我只有 90% 把握」。

我們的第一步，就是用 FastQC 或 Trimmomatic 這類工具，把那些機器自己都沒信心的、品質低落的部分...咔嚓，剪掉。還有一些定序時會加進去的接頭序列 (Adapters) 也得清掉，確保留下來的都是乾淨、可信的 DNA 序列。沒做好這一步，後面分析出來的就全是垃圾。

第二站：組裝 (Assembly) - 拼湊破碎的書頁

清完資料後，你手上還是有好幾百萬、甚至上億個短短的 DNA 碎片。它們就像是幾十本不同作者寫的書，被丟進碎紙機後混在一起。你要怎麼把它們拼回原本的句子或段落？

這就是「組裝」。我們會用像 MEGAHIT 或 SPAdes 這樣的工具，它們很聰明，會去找這些碎片之間重疊的地方，然後「縫合」起來，變成比較長的連續序列，我們稱之為「Contigs」。

這大部分是所謂的「De novo 組裝」，意思就是完全不靠參考書（參考基因組），純粹靠碎片之間的相似度去盲拼。這在宏基因體學裡很常用，因為你根本不知道樣本裡有多少是前所未見的新物種啊。

第三站：分箱 (Binning) - 把拼圖塊依顏色分類

好，我們現在有了一堆比較長的 DNA 片段 (Contigs)，但還是有個問題：A 片段是來自細菌甲，還是細菌乙？B 片段跟 C 片段是同一個生物的嗎？不知道。

所以就要「分箱」。這一步是把那些看起來源自同一個物種的 Contigs 圈在一起，變成一個一個的「箱子 (Bin)」。最後每個箱子裡的東西，就約等於一個物種的基因組草圖，也就是所謂的「MAGs」(Metagenome-Assembled Genomes)。

但電腦怎麼知道哪些片段是同一國的？它不是靠長相，而是靠一些 DNA 的內在特徵。比方說：

GC 含量：不同生物的 DNA 序列中，G和C這兩個鹼基所佔的比例會不太一樣，這是一個蠻穩定的特徵。
四核苷酸頻率 (Tetranucleotide frequency)：這超酷的。你可以想像 DNA 的 ATGC 四個字母能組成的「四字詞」，總共有 256 種組合（AAAA, AAAT, ATAG...）。每個物種在使用這些「四字詞」時，都有自己獨特的偏好和頻率。工具就是靠分析這種「用詞習慣」，來判斷哪些片段可能是同一個作者寫的。
覆蓋率 (Coverage)：在定序時，如果某個物種在樣本裡數量很多，牠的 DNA 片段自然就會被讀到很多次，覆蓋率就高。反之亦然。所以覆蓋率相似的 Contigs，也很有可能是來自同一個生物。

常用的分箱工具有 MetaBAT 2、MaxBin 2 這類的。分箱這一步，可以說是在一片混沌中，首次建立起秩序。讓你知道，這堆 DNA 碎片，大概、可能、或許...是由眼前這幾十個或幾百個不同的「物種」所組成的。

第四站：物種註解 (Taxonomic Classification) - 牠到底是誰？

有了 MAGs，我們終於可以問一個關鍵問題了：「所以...這些傢伙到底是誰？」這就是物種註解，或叫物種分類。

這一步跟前面不一樣，需要用到龐大的「參考資料庫」。工具會把你手上的序列，拿去跟資料庫裡成千上萬筆已知的微生物基因組做比對。然後告訴你：「欸，你這個 Bin 01，有 95% 的機率是某種大腸桿菌 (E. coli)」、「Bin 02 找不到對應的，可能是個新物種喔！」。

這就有點像...嗯...寶可夢圖鑑。你抓到一隻新的，拿圖鑑掃一下就知道牠是不是皮卡丘。不過，我們的微生物圖鑑還很不完整，所以常常會有一堆「未知圖騰」，也就是 unclassified 的東西。

第五站：功能註解 (Functional Annotation) - 牠們會做什麼？

知道「有誰在」之後，更有趣的是想知道「牠們會做什麼」。

功能註解，就是去分析這些基因序列，預測它們各自的功能是什麼。比如，這個基因可能是負責代謝糖分的，那個基因是製造某种抗生素的，還有一個基因...嗯，可能是讓細菌產生抗藥性的。這一步超級強大，因為就算你遇到一個全新的物種，你還是能透過分析牠的基因，去推斷牠在生態系裡扮演的角色，或是它有什麼潛力。

這就等於，你不只認出了皮卡丘，你還知道牠會「十萬伏特」。

該用哪個工具？其實是個取捨問題

說到物種跟功能註解，市面上工具一堆，新手常常看到頭昏。老實說，沒有哪個是完美的，選哪個通常看你的需求。就拿最常見的物種註解工具 Kraken2 和 Kaiju 來比較好了，我自己是覺得可以這樣看：

工具	原理	優點	缺點	什麼時候用？
Kraken2	k-mer 比對。就是把你的 DNA 切成一堆小碎片 (k-mers)，然後快速去資料庫裡找誰家有最多一樣的碎片。	快！真的快到嚇死人。資料量再大都沒在怕的。對電腦要求也比較低。	比較「死板」一點。如果你的物種跟資料庫裡的親戚差太遠，它可能就認不出來了。	資料量超大、想快速得到結果、電腦記憶體有限的時候。基本上是大部分人的第一選擇。
Kaiju	蛋白質序列比對。它會先把你的 DNA 序列「翻譯」成蛋白質序列，再拿去比對。	更靈敏！因為蛋白質序列在演化上比 DNA 序列更保守（變化比較慢），所以它很會找「遠房親戚」，更容易發現新物種的線索。	慢...說真的蠻慢的。因為要多一道翻譯的手續，超級耗運算資源。	當你懷疑樣本裡有很多新東西、想做探索性研究、而且...嗯...不趕時間的時候。

還有啊，說到資料庫，大家最常用的就是美國 NCBI 維護的 GenBank，它就像個全球最大的生物資料超級市場，什麼都有。不過呢，有時候你想研究的東西如果跟台灣的環境或族群關聯性比較高，直接用 GenBank 的資料去比對，效果不一定最好。這時候反過來去找找台灣本地的研究單位，像是中研院或國衛院自己建置的資料庫，雖然規模小得多，但可能因為更「在地化」，反而能給你更精準的答案。這點我覺得是分析時可以考慮的。

最後一步：統計和視覺化 - 讓數據說故事

終於，最痛苦的資料前處理階段過去了。你現在手上有一堆表格，記錄著每個樣本裡有哪些物種、各有多少、以及它們有哪些功能基因。

接下來就是生物統計學家和視覺化工具登場的時候了。我們會用 R 語言或 Python，搭配像 QIIME 2 或 phyloseq 這樣的套件，開始問問題：

Alpha 多樣性：單一一個樣本裡面，物種多樣性高不高？就像看你家實驗室有多少種不同規格的微量吸管。
Beta 多樣性：不同樣本之間的群落組成差異大不大？這就像比較你家實驗室和隔壁實驗室的吸管收藏，看看誰的種類比較奇特。（對了，偷偷借隔壁的 2μL 微量吸管如果沒被發現，應該...不算偷吧...？）

然後把結果畫成各種圖，像是熱圖 (Heatmaps)、主成分分析圖 (PCA plots) 等等。到了這一步，原本冰冷的數據才開始有了溫度，你才能從中看出趨勢、找到模式，真正開始「解讀」這個微生物群落想告訴你的故事。